[Principle & Protocol] 박테리아 배양 (Bacterial cell culture) - (2) 도말법

1. 도말법

 1.1. 도말법의 정의 및 목적

  정의 - petri dish 등에 굳힌 반고체형 배지 (agar plate)에 균액이 스며들게 접종하여 배양하는 방법

  목적 - 박테리아의 single colony를 획득

     cf) single colony를 얻는 이유

     - 미생물 분리 (isolation) : 미지의 샘플(균) 접종 시 최소 2종 이상 섞여있을 수 있기 때문에 순수분리를 위해 single colony로 희석하기 위해 도말법 사용

     - 미생물 계수 (count) : 1 colony = 1 live cell의 증식 결과로 생각 → 세균 수 측정 단위 = CFU (colony forming unit)

     - 유전적 동일성 (genetic background) : 1 live cell이 증식한 것이기 때문에 완전히 동일한 유전형을 가졌다고 생각(실험에 사용 시 동일 genetic background 개체를 이용하는 것이 중요)

 

 1.2. 도말법의 종류

  1.2.1. 평판도말 (spreading)과 획선도말 (streaking)

 도말법은 크게 평판도말 (spreading)과 획선도말 (streaking)으로 나뉜다.

 (pour plate method라고 하여 균 배양액을 melted medium가 혼합하여 굳히는 방식이 있긴하나, 소요시간 등 그 효율성이 떨어지는 방법이라 잘 쓰지 않기에 생략한다. 그래도 궁금한 사람은 다음 주소에 들어가면 도움이 될 것이다. https://microbeonline.com/pour-plate-method-principle-procedure-uses-dis-advantages/)

 

 Spreading은 도말봉 (spreader)를 이용해서 접종액을 agar plate에 얇게 펴 발라서 접종하는 방법이며, streaking은 백금선 등의 inoculation loop를 이용하여 접종하는 방법이다 (그림 1).

 
<Spreading 특징>

 - Spreading은 음식 내 균 오염, 환경 샘플에서 균총 분리 및 규명 등에 쉽게 사용될 수 있음

 - 그러나 고농도의 샘플일 경우 적정 농도로 희석이 되지 않되면 one single colony를 얻는데 어려울 수 있음

 - Colony가 배지에 고루 깔릴 수 있도록 spreader로 균형있게 펴줘야 함 (과도한 힘은 배지를 찢거나 petri dish 외부에만 colony가 몰릴 수 있음)

 
<Streaking 특징>
- Streaking은 획선을 통한 연속적인 희석을 통해 박테리아의 순수한 colony를 분리할 수 있음
- 고농도의 혼합 샘플이어도 이는 마찬가지인데, 보통 4분할 도말법을 하면 3, 4번째 획선에서는 single colony가 획득됨
- 분할의 횟수에 따라, 1분할법, 4분할법 등으로 부르고 보통 4분할법 (quadrant streaking)을 가장 많이 씀
- 1분할법은 백금선을 한 번도 떼지 않고 그대로 획선하는 방법이고, 4분할법은 4번의 선으로 나누어 도말하는 방법으로 다음 분할 시작 때 이전 도말의 끝부분을 걸쳐서 그어 주는 것이 특징 (그림 1).

 

이후 도말이 완료된 샘플은, 배양기에 넣고 균 생장 조건을 맞춰준 뒤 18~24시간 정도 뒤 colony 형성된 것을 확인하면 된다.

 

그림 1. Spreading과 Streaking (ref: modified from https://microbeonline.com/spread-plate-technique-principle-procedure-results/ & https://microbeonline.com/streak-plate-method-principle-purpose-procedure-results/)

 

 

  1.2.2. 도말 시 유의사항

 - 도말봉, 백금선 등 화염멸균 후 충분히 식힌 뒤 사용할 것 (식히지 않으면 균이 죽은 상태로 도말되어 colony 형성이 되지 않음)
- 여러 샘플을 도말할 시, 오염 방지 및 실험 시간 단축을 위해 여러 개의 streaker 혹은 백금선을 준비해두고 번갈아 화염멸균 시키며 사용할 것

 - 도말 후 배양기에 넣을 때 plate는 뒤집어 놓을 것 (오염 방지)

 

 

References

 - https://microbeonline.com/pour-plate-method-principle-procedure-uses-dis-advantages/
- https://microbeonline.com/spread-plate-technique-principle-procedure-results/
- https://microbeonline.com/streak-plate-method-principle-purpose-procedure-results/

 
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