[Principle & Protocol] 박테리아 배양 (Bacterial cell culture) - (1) 원리, 종류, 주의점

1. 균 배양 관련 총론

 1.1. 균 배양의 원리

 1.1.1. 균 (Bacteria)란?

 균 (Bacteria)는 원핵생물 (prokaryotic)의 일종으로 미토콘드리아와 같은 공생관계부터 슈퍼 박테리아 등에 의한 질병을 일으키는 원인에 이르기까지 인간과 매우 많은 상호작용을 하며 살고 있다. 특히 최근에는 장내균총을 비롯한 인간의 몸 곳곳에 다양한 미생물 군락이 자리를 잡고 있으며, 이들이 단순히 기생하는 것이 아니라 그 숙주 (host)인 인간의 생리에 지대한 영향을 끼치는 쌍방향적 소통 관계라는 것이 밝혀지고 있다. 이에 최근에는 장내균총을 아예 하나의 독립적인 기관 (organ)으로 여기거나, 집단미생물의 특징 또한 그 숙주의 특성으로 여기는 초유기체 (superorganism)적 접근이 활발한 상태이다. 실제로 이러한 접근 방식으로 이전에 해결하지 못하고 있던 다양한 질환들에 대해 새로운 치료제 개발이 연구되고 있다. 

 균은 크게 그람염색 유무에 따라 그람양성균 (gram positive bacteria)와 그람음성균 (gram negative bacteria)으로 분류되고, 이들은 곧 아미노산과 탄수화물로 구성된 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 층이 세포외벽에 노출되어있느냐의 차이다. (이는 세포외벽 구성물질의 차이로 이어지고, 균의 병원성 등과도 관계가 있다. 이에 대해서는 후에 기회가 되면 따로 올리겠다.)

 또 원핵생물이기 때문에 따로 세포소기관이 없고, 증식은 이분법을 이용한다. 서식환경은 종류에 따라서 매우 천차만별이며, 이 때문에 뒤에 설명할 균 배양에 있어서도 적정한 조건을 충족시켜주는 것이 중요하다. 바꿔말하면, 다양한 조건에 적응하도록 진화한 균을 잘 이용한다면 산업적으로 무궁무진하게 응용할 기회가 있다는 뜻이 되기도 한다. 예를 들어, 일부 세균은 필수 영양물질이 고갈되는 등의 척박한 환경에 노출되면 포자 (spore)를 형성하기도 하는데, 이러한 특성을 응용하여 내열성이 강한 생균제 제품이나 전달체 등을 개발하기도 한다.

 결론적으로, 균은 인간의 건강에 지대한 영향을 끼칠 수 있으며, 그 종류에 따라 미치는 영향이 상이하고 특성이 달라 다양한 산업적 응용 가능성을 내포하고 있는 매력적인 존재이다.

최근에는 장내균총을 아예 하나의 독립적인 기관 (organ)으로 여기거나, 집단미생물의 특징 또한 그 숙주의 특성으로 여기는 초유기체 (superorganism)적 접근이 활발한 상태이다. 실제로 이러한 접근 방식을 통해 이전에 해결하지 못하고 있던 다양한 질환들에 대해 새로운 치료제 개발이 연구되고 있다. ...

결론적으로, 균은 인간의 건강에 지대한 영향을 끼칠 수 있으며, 그 종류에 따라 미치는 영향이 상이하고 특성이 달라 다양한 산업적 응용 가능성을 내포하고 있는 매력적인 존재이다. ...

 1.1.2. 균 배양

 앞서 말했듯 균은 연구하기 매우 매력적인 소재이다. 연구를 하기 위해서는 통제가능한 범위에서 이들을 지속적으로 증식하고 보관하는 것이 필요하고, 이 때 배양이 필수적이다. 배양을 한마디로 요약하자면, 균이 필요한 조건 (영양원, 온도, 기체 등)을 공급해줌으로써 균의 증식을 유도하는 것이다. (이는 균 뿐만 아니라 동물세포 등도 모두 동일한 원칙을 따른다.)

 

 1.1.2.1. 산소의 유무

 대표적인 조건이 배양 시 산소가 필요한가 여부이고, 다음과 같이 분류할 수 있다. 

 

    1) 편성 호기성 (obligate aerobe): 배양하는데 산소가 꼭 필요한 균 / 공기 중 유리 산소를 이용하여 영양소를 산화, 분해하는 세포호흡 이용 ex) 아세트산균 등
2) 미호기성 세균 (microaerophile): 대기 중 산소분압보다 낮은 산소 농도에서 생장 ex) 헬리코박터 균 등
3) 통성 혐기성 세균 (facultative anaerobes): 산소 유무와 상관없이 생장 가능 / 무산소 호흡 (fermentation)과 산소호흡 (aerobic respiration)이 모두 가능 ex) 유산균 등
4) 편성 혐기성 세균 (obligate anaerobe): 산소 있는 상태에서 생육할 수 없는 세균 ex) 대부분의 장내미생물 균
5) 내산소성 세균 (aerotolerant anaerobe): 산소에 독성을 보이진 않으나 에너지(ATP) 생산에 산소가 필요하지 않은 균 / superoxide dismutase, peroxidase는 있으나 catalase는 없음

 

 

 산소가 미생물의 생장가능 환경에 큰 영향을 미치는 이유는, 산소 분자 혹은 산소 라디칼과 반응하는 다양한 효소들을 미생물이 가지고 있느냐에 따라 이를 물질대사에 사용할 수 있는지가 결정되기 때문이다. 산소가 물질대사에 이용되었을 때에는, 크게 과산화수소를 (H2O2) 비롯한 과산화물 (superoxide)과 이로부터 파생되는 산소 라디칼 (O2-)등을 최종 산물로 생산하는데 이들은 모두 산화제로 작용하여 세균 내 시스템에 손상을 가한다. 호기성 세균이나 내산소성 혐기균은 이런 손상을 억제할 수 있기 때문에, 산소의 존재 하에서 생존하며 증식이 가능하다. 보통 이에는 superoxide dismutase라는 효소가 있어서 과산화물을 보다 안정적인 형태인 산소 분자로 환원시켜주는 식으로 이루어진다. 이 반응의 생성물은 산소 분자와 함께 과산화수소인데, 과산화수소 역시 peroxidase (NADH2를 NAD+로 전변하면서 과산화물의 환원) 혹은 catalase (2H2O2 -> 2H2O + O2)에 의해 최종적으로는 물 분자 혹은 산소분자로 분해되어 세포 내에 라디칼이 쌓이는 것을 막아준다 (그림 1).
반면에, 편성 혐기성 세균의 경우에는 이 효소들 (superoxide dismutase, peroxidase, catalase)가 결핍되어있거나 부족하기 때문에 산소에 노출되었을 때, 이로 인해 생성되는 산소 라디칼에 대처를 할 수 없어 증식을 하지 못하는 것이다.

 

그림 1. 미생물 내 산소 관련 효소 반응 (ref: http://textbookofbacteriology.net/nutgro_4.html)

  산소요구성은 미생물 연구에서 매우 중요한데, 실제로 이를 고려하지 못하고 미생물 동정에 배양 의존적 방식 (culture-dependent analysis)의 방식이 주를 이루었을 때는, 분변 샘플을 배지에 접종 했을 때 호기성 세균 Escherichia coli가 대장 유래 샘플로부터 dominant하게 동정이 되어 - 염기서열 기반의 배양 비의존적 분석 시에는 장내 세균 중 그 비율이 1% 이하에 불과함에도 불구하고 - 오늘날까지 ‘대장균’이라고 불리며 마치 장내 미생물의 대표적 종인 것인 것 마냥 불리고 있다. 현재는 산소를 차단한 배양기술 (혐기성 배양 챔버 등) 등이 발달하여 배양의존적으로도 장, 반추위 등 혐기성 미생물이 다수를 차지하는 기관 내 미생물 균총 분석이 가능해졌다.

 

그 외에도 pH (호산성- ,호중성-, 호염기성-, 극호염기성- )나 온도 (저온-, 내저온-, 중온-, 고온-, 초고온-), 용질 및 수분 활성도 (내삼투성-, 호염성-) 등으로 분류할 수도 있다.

 1.2. 균 배양의 종류

균 배양의 큰 흐름은 접종-배양-목적에 맞는 추가실험의 순으로 이루어진다.

 

1.2.1. 접종
: 미생물 원료 (thawed stock 혹은 lyophilized powder, 환경에서 수득한 샘플)를 배양 가능한 배지에 노출시키는 것을 뜻한다. 1 colony picking이나 stock을 적정 v/v 비율 - 보통 0.1-1% - 로 배지에 처리하면 된다.

1.2.1. 배양
: 미생물의 증식에 적절한 배지, 적정 온도, 교반 유무 (산소 요구성), 배양시간을 처리하는 것
배지는 미생물 성장에 필요한 영양분을 함유한 것으로써, 그 성분에 따라 미생물 분리동정 등도 가능하다. 예를 들어, 생존과 증식에 필수적으로 특정 성분이 필요한 경우 - 특정 영양소 생성효소 결핍 균주 개발 유무 판단 -이거나, 특정 영양물질을 포함한 경우 (선택 배지) - 항생제 포함 배지를 이용하여 항생제 저항성 유전자 균주 선발 - 등이 대표적인 예이다.
배양은 크게 교반의 유무에 따라 진탕배양, 정치배양으로 나눌 수 있다.
교반은 지속적으로 산소와 같은 기체 공급과 배지 내 균의 고른 분포 등을 위해 필요하며, 호기성 세균의 배양에 필요하다. 이외에는 균을 접종한 배지를 배양기에 가만히 놔두는 정치배양이 있는데, 배지의 밑부분일수록 더 강한 혐기성이 된다.

 

 1.3. 균 배양 실험 시 주의점

 

  균과 관련된 모든 작업은 기본적으로 연구하고자 하는 균 (혹은 균총) 외에 다른 균이 실험에 영향을 주지 못하도록 해야한다. 그렇기 때문에 클린벤치와 같은 무균 상태를 유지할 수 있는 독립적 공간에서 진행하는 것이 필요하다. 또한 실험 용기 등 균이 있어야할 위치 외에 균이 노출 되었을 시 즉시 알코올 소독 등으로 제거하여 오염되는 것을 방지해주어야 한다. 결국 가장 중요한 것은 청결의 유지이다.

미생물 배양방법 중 streaking & spreading의 비교, 미생물 계수법, 생장 곡선 별 특징 등은 다음 글에서 언급하겠다.

 

References

http://textbookofbacteriology.net/nutgro_4.html

 

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