1. COVID-19 진단 검사
1.1. 진단의 중요성
- COVID-19와 같은 전염병의 확산을 제어하기 위해서는 치료법 개발만큼이나 진단 기술의 개발이 중요
- 진단에 있어 중요하게 고려되어야 할 대표적 요소는 신속성, 정확성, 용이성 [1]
- 즉, 좀 더 간단한 방법으로, 좀 더 빠른 시간 내에, 좀 더 정확한 진단 기술을 확보하는 것이 초기 질병 억제의 핵심
1.2. 주요 방법
- 주요한 COVID-19 진단 방법으로는 분자진단 (PCR 검사), 면역화학진단 (항원, 항체 검사)이 대표적
- 분자진단이란 SARS-CoV-2의 RNA 등 인체의 핵산(DNA, RNA)정보를 기반으로 하는 진단방법 →검체 내 병원균 특이적 유전자가 증폭되는지 여부로 감염여부를 진단
ex) 씨젠의 Allplex™ 2019-nCoV assay [1]
- 면역화학진단이란 항원-항체 반응을 통해 질병의 원인 혹은 감염시 생성되는 단백질 유무를 확인 / 질병의 원인(항원)을 검출하면 항원검사, 감염시 생성되는 항체를 검출하면 항체검사
ex) 피씨엘 COVID-19 Ag GICA Rapid 키트(항원검사) / 수젠텍 SGTi-flex COVID-19 IgM/IgG(manual) (항체검사)
- 진단 기기 공개현황 (2020. 5. 6 기준, 진단기기 개발분야 글로벌 비영리 단체 FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics, WHO협력기관)에서 파악) [2]
: 분자진단기기- 총 309개(상용화 265개, 국산 23개 회사 28개 제품)
면역화학진단기기 - 총 310개(상용화 262개, 국산 9개 회사 24개 제품)
- 진단검사 별 특성 (그림 1, [2])
* 임상적 민감도 (질환 가지고 있는 사람이 양성으로 판명될 확률) / 임상적 특이도 (질환 가지고 있지 않은 사람이 음성으로 판명될 확률)
2. What is SHERLOCK?
2.1. 기본 정보
- CRISPR 유전자편집 기술 [CRISPR 관련 내용은 다음 링크 참고, 3] 연구의 선구자 중 한 명인 Zhang Feng을 필두로 세운 Sherlock Biosciences, Inc.의 핵심기술
- Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing의 약자로 검체 내 특정 유전물질의 존재 여부를 CRISPR기술로 확인하는 것
- 최초의 CRISPR 기반 진단 기술의 FDA 사용 승인 허가 사례 [4] (CRISPR SARS-CoV-2 rapid test kit)
2.2. 작용 기전
- SHERLOCK은 분자진단 방식의 일종
- 유전물질 검출 방식: Collateral cleavage (그림 2)
: Cas13a 단백질이 타깃 RNA(crRNA or ssRNA; CRISPR RNA or single strand RNA)를 만났을 때 → 이를 자를려고 활성화
→ 주변의 RNA도 무작위로 자르는 특성 (collateral cleavage)을 이용
: 잘리면 형광을 띠는 RNA probe를 함께 넣어줌 → SARS-CoV-2 서열과 만나 활성화된 Cas13a → probe도 잘라내 형광신호를 발생
→ 감염 여부 진단
- Target RNA : Orflab gene, S gene (Q. 2개인 이유? cross-check를 통해 정확성 높히기 위해)
- 키트 사용 순서 및 소요 시간 [5]
(1) 핵산 등온 배양 (소요시간 25min)
- 검체 유래 핵산 등온 증폭 by RPA (recombinanase polymerase amplification)
: dsDNA의 경우 RPA이지만 SARS-CoV-2는 RNA바이러스이므로 RT-RPA를 통한 cDNA 형성
(2) Cas13a를 이용한 RNA sequence 탐지 (소요시간 30min)
: T7 RNA polymerase이용한 DNA→RNA로 전사
(3) 결과 확인 (소요시간 2min) - visual read-out of the detection
*비슷한 원리의 경쟁사 기술 - DETECTR (DNA Endonuclease-TargEted CRISPR Trans Reporter) (그림 3)
- 또 다른 거장 Jennifer Doudna가 세운 Mammoth Biosciences Inc.의 CRISPR 기반의 유전물질 (ssDNA; single strand DNA) 진단 방식
- SHERLOCK이 Cas13a를 썼다면, 여기서는 Cas12a (Cpf1)를 효소 단백질로 사용
- Loop-mediated amplification (RT-LAMP)를 이용해 역전사와 DNA 증폭이 동시에 일어남
- Target gene: E gene (envelop gene) 과 N gene (nucleocapsid gene)
2.3. 기존 기술 대비 우수성 및 주의사항
2.3.1. 우수성
- 높은 민감도 : attomolar (10^-18 수준)단위의 고감도 검출 가능 (=초기 감염도 감지 가능)
- 빠른 검사시간: 30분~1시간 (기존 분자진단 4~6시간)
- Scale-up의 용이: 대단위 검사에 사용하기 적합 (유전자 증폭해서, Cas13a 처리해주고, 형광 발현 여부 확인하면 끝 → 96 well 플레이트에 1 well당 환자 1명 검체로 동시 처리 가능할 듯)
- 별도의 전문 장비 불필요 (37도와 42도를 맞춰줄 항온 수조, 원심분리기만 있으면 됨)
2.3.2. 주의사항
- off-target effect 발생 가능성(비특이적 절단에 의한 probe 검출)
→ 해당 그룹에서는 정확성 100%라고 주장 (기사에 따르면, 환자 샘플 이용시 100%라고 보도됨 -> 즉, 민감도는 매우 높은 것 확인했으나 아직 특이도에 대한 부분은 미지수인 듯함
3. Sherlock의 의의
- CRISPR의 새로운 응용 분야 제시
- 질병 치료보다 빨리 상용화될 수 있는 분야인 진단 → CRISPR 기반 회사의 cash-cow가 될 가능성이 큼 (치료제 개발까지 필요한 자금 확보 가능)
: point mutation 질환 등 치료에 응용할 때는 cleavage 이후 원하는 염기로 바뀌어야하는 반면, 검체 내 유전물질 검출은 탐지만 되면 됨
- 질병 진단에 중요한 요소인 간단함, 신속함, 정확함을 모두 만족시킬 수 있는 새로운 유형의 진단기술
References
[1] https://komok.tistory.com/7
[2] 권덕철, 보건산업브리프 Vol.303 코로나19 진단기기 산업현황 및 수출전망, 한국보건산업진흥원
link: https://www.khidi.or.kr/board/view?linkId=48827232&menuId=MENU01783&schStartDate=&schEndDate=&categoryId=
[3] https://m.terms.naver.com/entry.nhn?docId=3579696&cid=58943&categoryId=58966
[5] Zhang, F., Abudayyeh, O. O., & Gootenberg, J. S. (2020). A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics. A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, 8.
Link: https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e7773f40df723159b16f262/1584886772519/COVID-19+detection+%28v.20200321%29.pdf
[6] Bai, H., Cai, X., & Zhang, X. (2020). Landscape Coronavirus Disease 2019 test (COVID-19 test) in vitro--A comparison of PCR vs Immunoassay vs Crispr-Based test.
Link: https://osf.io/6eagn/
[7] Alyssa Cecchetelli. (2020). Finding nucleic acids with SHERLOCK and DETECTR.
Link: https://blog.addgene.org/finding-nucleic-acids-with-sherlock-and-detectr
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